内容
| 電子顕微鏡の一技術として、急速凍結法が近年開発され、氷に封じられた細胞やウイルスを生状態で観察できるようになった。ホルマリン漬けにしたり、重金属で染色したりする破壊的試料作成法を避ける画期的手法であるが、像のコントラストが弱く微小形態の特定が困難であった。この問題は生理研の永山教授らが開発した位相電子顕微鏡法により解決され、共同研究者のWah Chiu教授率いるベイラー医科大のグループにより、地球上炭酸ガス固定の主役シアノバクテリア中でのウイルスの立体構造形成の解明に応用された（図1）。感染初期にまずウイルスの外殻ができ、次にDNAゲノムがその中に封入され、最後に角や尾が出来る形作りの過程（図2）が明らかにされ、ウイルス感染の生活史モデルが提出された（図3）。 |
無染色で透明な生きた細胞の微細観察を最初に可能としたのは、光学顕微鏡の位相差法で、オランダのFritz Zernikeにより発明され1953年のノーベル物理学賞に輝いた。同じ方法を電子顕微鏡に応用する試みは50年以上続けられてきたが、その成功は21世紀になりはじめて生理研永山教授のグループにより達せられた。鍵となったのは、位相差法の心臓部である薄い炭素膜でできた位相板の帯電防止法の確立だった。今回のウイルス感染生活史研究はこの位相差電子顕微鏡が医学生物学研究に真に役立つ強力な方法であることを実証する金字塔といえる。
永山教授は「今回の研究で、10年来地道に続けてきた位相差電子顕微鏡の開発研究が医学、生物学分野で正しく評価されることを期待している。」と話しています。
本研究は国際共同研究として行われました。参照：（https://www.bcm.edu/news/biochemistry-and-molecular-biology/tecnique-sharpens-view-of-phage-assembly）
今回の発見
1．シアノバクテリア内のウイルス感染生活史は地球上炭酸ガス固定の主役シアノバクテリアの生態系を明らかにする。
2．今回のウイルス感染生活史全容解明と同等のことがヒト細胞で可能となれば、ウイルス感染対策の前進が期待される。
3．位相差電子顕微鏡が医学生物学研究の最先端を切り拓く有力な方法であることが実証された。
図1 シアノバクテリアと感染したウイルス（バクテリオファージ）の立体像。金色の楕円構造がバクテリアの細胞壁。バクテリア内にちらばる赤紫色粒子がウイルス
急速凍結法により氷に閉じ込められたシアノバクテリアについて、位相差電子顕微鏡より内部のウイルスを含めたシアノバクテリアの微細立体構造が明らかとなった。（ベイラー医科大のホームページより）
図2 感染過程で変わるのウイルスの立体構造（左側：位相差電子顕微鏡像、右側：ウイルス立体構造モデルー下から上に成人型）
感染初期にシアノバクテリアに注入されたウイルスのゲノムDNAはその遺伝情報を使い、シアノバクテリアにウイルスの蛋白質外殻（キャプシド）を作らせる。そのキャプシドがDNAを内包し最後に角や尾を付加する感染生活史の全容が、各段階の立体構造解明により明らかになった。（Nature論文より）
図3 細胞内でのウイルス感染生活史モデル
図2に示す各段階の立体構造がどのような順序でウイルス形成に関わるのか。その形成過程を示す生活史モデルが構築された。（Nature論文より）
この研究の社会的意義
地球上炭酸ガス固定の主役シナノバクテリアのウイルス感染生活史解明を通じ、CO2問題の解決につながる期待および位相差電子顕微鏡法によりヒトウイルス感染の詳細が解明され、予防や治療につながる期待がある。
論文情報
Visualizing virus assembly intermediates inside marine cyanobacteria.
Wei Dai, Caroline Fu, Desislava Raytcheva, John Flanagan, Htet A. Khant, Xiangan Liu, Ryan H. Rochat, Cameron Hasse-Pettingell, Jacqueline Piret, Steve J. Ludtke, Kuniaki Nagayama, Michael F. Schimid, Jonathan A. King & Wah Chiu.
Nature. 2013年10月31日号
お問い合わせ先
＜研究について＞
自然科学研究機構 生理学研究所 特別研究
特任教授 永山國昭 （ナガヤマクニアキ）
Tel: 0564-59-5212 FAX: 0564-59-5212
email: nagayama@nips.ac.jp, knagayama100@gmail.com
＜広報に関すること＞
自然科学研究機構 生理学研究所 広報展開推進室
TEL: 0564-55-7722、FAX: 0564-55-7721
email: pub-adm@nips.ac.jp
自己抗体は文字通り自己の蛋白質に対して反応し、細胞、組織、臓器に障害を引き起こします。今回、研究グループは脳神経細胞の蛋白質に対する既知の自己抗体（黒字の蛋白質に対する抗体）に加えて、さまざまな蛋白質に対する新規の自己抗体（赤字の蛋白質に対する抗体）を発見しました。
今回、多数の新規自己抗体の標的抗原を同定したことにより、一人の患者血清中にどのタイプの抗体がどの程度存在しているかを簡便、高感度、かつ特異的に測定することが可能となりました。
LGI1抗体価（縦軸）とCASPR2抗体価（横軸）と疾患との関連性を示しています。LGI1抗体価が0.8以上の患者さんは殆ど例外なく辺縁系脳炎と診断されていたことが明らかになりました（左上の赤色の群）。一方、CASPR2抗体価が0.3以上の患者さんはニューロミオトニア（神経筋緊張病）のケースが有意に多いことが分かりました（右中央の青色の群）。
通常、LGI1はシナプス間隙でADAM22、ADAM23と結合し、AMPA型グルタミン酸受容体を精緻にコントロールしています。一方、LGI1の機能が自己抗体により後天的に阻害されると、シナプスにおけるAMPA型グルタミン酸受容体機能が低下し無秩序なシナプス伝達が生じます。その結果、痙攣発作を伴うてんかん病態や記憶障害が生じると考えられます。
チャネルロドプシン２（ChR2）をグリア細胞に発現させ、これを光で刺激すると、グリア細胞内が酸性化することが明らかになった。この酸性化が引き金となって、細胞質内の陰イオンであるグルタミン酸が、細胞を囲む膜に存在する陰イオンチャネルを介して細胞外へと放出されることが分かった。このようにして、グリア細胞の活動は神経細胞に伝わり、最終的には学習等の脳機能に影響することが示唆された（本研究およびSasaki,…,Matsui*, PNAS, 2012 参照）。
A, 脳虚血時には、血管（上丸）からの酸素とグルコースの供給が止まり、グリア細胞のグリコーゲンが分解され、乳酸が蓄積することで細胞内が酸性化する。この酸性化がグリア細胞からの過剰なグルタミン酸放出につながると考えられる。B, 脳虚血によって生じるグリア細胞内の酸性化は、グリア細胞に発現させたアーキオロドプシン（ArchT）の光刺激によって、拮抗させることができる。このとき、グリア細胞からのグルタミン酸放出が抑制され、過興奮による神経細胞死を防ぐことができた。
A, チャネルロドプシン２（ChR2）は、主に水素イオンを通すので、細胞内を酸性化する働きがある。細胞内pHイメージングによって酸性化を確認した。B, アーキオロドプシン（ArchT）は、逆に、水素イオンを細胞外に汲み出す光作動性のポンプである。細胞内pHはアルカリ化することが確認された。C, 小脳スライス標本を浸す灌流液から酸素とグルコースを抜く（OGD）と、グリア細胞内が急速に酸性化する。神経細胞（プルキニエ細胞）から電気記録を取ると、OGDとともに興奮性内向き電流が流れる。D, グリア細胞に発現させたArchTを光刺激してグリア細胞内の酸性化を拮抗させると、興奮性内向き電流が大幅に抑制された。グルタミン酸受容体阻害剤による効果とほぼ同じであることから、ArchT光刺激によってグリア細胞からのグルタミン酸放出が止まったと考えられる。
A, Rose bengal法により人工的に脳梗塞を作った。B, ３時間の局所的脳梗塞で大規模な構造的ダメージが観察されたが、その期間中、グリア細胞に発現させたArchTを間欠的に光刺激し続けた群においては、障害を抑制することができた。
マウスのTRPA1は低温に反応すると報告されていますが、ニワトリTRPA1は低温刺激には反応せず、高温刺激を与えた場合にのみ明瞭な電流応答が生じました。また、ワサビの辛み成分であるアリルイソチオシアネート（AITC）にも反応しました。ニワトリではTRPA1は高温と刺激性化学物質のセンサーとして機能することを示しています。
アントラニル酸メチルに対するTRPA1の活性を5種の脊椎動物種間で比較したところ、ニワトリ、マウス、ヒトのTRPA1では明瞭な反応が観察されるのに対して、ニシツメガエルとグリーンアノールトカゲのTRPA1では反応が小さかった。また、ニワトリTRPA1のアントラニル酸メチルによる活性化には互いに近接した3つのアミノ酸が重要な役割を担うことが分かった。
高温センサーであるニワトリのTRPA1は、同じ恒温動物である哺乳類とは特性が異なり、むしろ、変温動物である両生類や爬虫類のTRPA1と類似していました。脊椎動物はもう一つの高温センサーとしてTRPV1を維持しているために、動物種によってはTRPA1の温度感受性が変化したと考えられます。一方、体にダメージを与え得る刺激を感じる能力はどの動物種にも必須であるため、いずれの動物種もTRPA1の化学物質感受性を維持してきたと考えられます。
突発性難聴の患者さんの正常な耳には耳栓をします。耳栓は入院中ずっとしてもらいます。そして聞こえにくい方の耳で入院中毎日６時間ヘッドホンから音楽を聞いてもらいます。
突発性難聴発症後の聴力を比較した。通常行われるステロイド療法にリハビリテーション療法を加えた患者群（灰色の棒グラフ）の方が、ステロイド療法単独の患者群（白色の棒グラフ）よりも聴力の回復が良かった（この図では棒グラフの値が０に近づくほど聴力が回復していることを示しています）。
リハビリテーション療法（音響療法）を行った患者に片耳から音を聞かせた時の脳活動を調べました。聴力低下の無い健常者では対側の脳の神経活動がやや大きいのですが（左右差＝約０．２）、突発性難聴発症時には脳神経活動にあまり左右差を認めませんでした。しかしながら、ステロイド+音響療法を行うと発症後約３ヶ月で、聴力低下の無い健常者の脳活動の左右差とほぼ同等になりました。
３つある脳室（側脳室、第3脳室、第4脳室）のすべての領域において脈絡叢（濃い紫の部分）は存在しています。脈絡叢は上皮細胞、軟膜、毛細血管から成る一層構造でTRPV4は上皮細胞の先端側に多く存在しています。上皮細胞ではトランスポーターやイオンチャネルにより絶えずイオンが血管側から脳室側へと輸送されているため、それに伴う水の移動が起こり、結果として脳脊髄液が脈絡叢から分泌されています。
TRPV4とアノクタミン１を共発現している細胞においてホールセルパッチクランプ法により観察されたクロライド電流。共発現細胞では、TRPV4アゴニストによって大きな電流が観察されます（左）。また、この電流は細胞外カルシウムを除去した状態では観察されないことから、TRPV4活性によるカルシウムの細胞内への流入がアノクタミン１を活性化させることが示されました（右）。
TRPV4とアノクタミン１を発現した細胞においてTRPV4活性化に伴い観察される細胞収縮のモデル図（左）。脈絡叢上皮細胞においてTRPV4が活性化するとTRPV4-アノクタミン１相互作用によりクロライドが流出し、TRPV4と結合する水チャネルを介して水流出も促進されると考えられます（右）。
Bre1aは、DNAが巻き付いているヒストンと呼ばれるタンパク質の１つ、H2Bにユビキチンと呼ばれるタンパク質を付加します。その反応が引き金になり、隣のヒストンH3がメチル化され、近傍の遺伝子の発現が活性化されます。
解説
B. 熱応答電流のアレニウスプロット
C. 胚発生期温度と休眠卵・非休眠卵表現型決定機構
